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Real-time PCR原理：基于探针的化学法，Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物，单单检测特异性扩增产物，DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR，探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性；探针可标记不同波长的荧光基团，用于多重PCR反应。对于不同的靶序列需要合成不同的探针，原料成本较高。聚合酶链反应的一个主要限制是，为了产生允许其选择性扩增的引物，需要关于目标序列的先前信息。无锡骨头RT-PCR检测技术网站

Real-time PCR链式反应的常见问题：靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。聚合酶链式反应准备：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。厦门血液荧光PCR研究方案聚合酶链反应是是一种简单，廉价和可靠的方法复制DN段。

Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待检测的样本中是否存在我们想要检测的成分，即待检测成分有无的分析。通常，定性分析可以应用于病毒以及病原菌的检测，物种鉴定以及基因分型等。病毒及病原菌检测，如SARS、H1N1病毒，都可以通过Real-time PCR的方法进行高灵敏度的检测，定性分析样本是否已被病毒传播。物种鉴定如我们国家的一些检验检疫机构，想要检测进口的牛肉制品中是否含有鸡源、猪源或鸭源等成分，或者用于检测羊奶中是否会掺有牛奶等等，可以通过Real-time PCR的方法进行检测。基因分型，如啤酒型，肥胖型基因的检测，就是Real-time PCR在基因分型方面的应用。

Real-time PCR反应：多重连接依赖探针扩增（MLPA):允许用单个引物对扩增多个靶标，从而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶链反应:由单个PCR混合物中的多个引物组组成，以产生对不同DNA序列特异的不同大小的扩增子。通过同时靶向多个基因，可以从单次测试中获得额外的信息，否则将需要几次试剂和更多时间来执行。每个引物组的退火温度必须优化，以在单个反应中正确工作，并符合扩增子尺寸。也就是说，当通过凝胶电泳可视化时，它们的碱基对长度应该足够不同以形成不同的条带。Real-time PCR在实验内参的设定主要为了用于靶RNA的定量。

所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。聚合酶链式反应的模板的取材主要依据PCR的扩增对象。厦门组织Real-time PCR方案

Real-time PCR技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化。无锡骨头RT-PCR检测技术网站

Real-time PCR：所谓Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入萤光基团，利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用萤光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标準曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重複性。该技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因晶片，siRNA干扰的实验结果。无锡骨头RT-PCR检测技术网站

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