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中盐核酸酶基本参数
  • 品牌
  • ArcticZymes Technologies
  • 型号
  • 70950-202/70950-150/70950-160
  • 货号
  • 70950-202/70950-150/70950-160
  • 中文描述
  • M-SAN HQ中盐核酸酶
  • 规格
  • 25kU/500kU/5MU
  • 级别
  • HQ及GMP
  • 应用领域
  • 大规模生物药生产中,去除核酸残留
中盐核酸酶企业商机

市售的M-SAN HQ中盐核酸酶有三个规格,分别是25kU、500kU及5MU,分别满足研发初期及大规模生产各阶段的要求。通过SDS-PAGE检测蛋白纯度在99%以上。基于ArcticZymes Technologies的30年的酶学开发及大规模生产经验,M-SAN HQ的生产体系稳定,产品纯度高,批次一致性好,无蛋白酶活性。厂家开发出特异的缓冲液体系,使M-SAN HQ保存起来更加稳定,-15℃ - -30℃条件下保存4年没有活性下降。研究数据表明,经过5-6次的反复冻融,M-SAN HQ中盐核酸酶活性没有明显变化。ArcticZymes的产品开发、生产、销售和营销过程均通过ISO13485质量标准的认证。湖北培养基条件中盐核酸酶70950-150

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逆转录病毒载体可以将7.5Kb左右外源基因整合入靶细胞基因组,并稳定持久地表达,已经在批准的CAR-T产品和许多临床产品中得到应用。Shou个成功的基因药物临床试验是利用小鼠白血病病毒(Murin Leukemia Virus,MLV,gamma逆转录病毒)作为基因转移载体医治儿童的X性染色体连锁严重联合免疫缺陷(SCID-X1)。目前上市的6个细胞药物产品全部采用逆转录病毒(3个为gamma逆转录病毒载体,3个慢病毒载体)作为基因转移载体。逆转录病毒载体目前常用的主要有两个:gamma逆转录病毒载体(Retroviral vector,RV)和慢病毒载体(Lentivirus vector,LV)。两种病毒均属于逆转录病毒科,在自身携带的逆转录酶催化下将其正链RNA均逆转录为cDNA。病毒颗粒比较大,约为100nm(70-100nm,有的至200nm),外层为表面突起的脂蛋白套膜,套膜内为20面体的衣壳(capsid),核衣壳内由一螺旋结构的核酸。河北等渗条件中盐核酸酶M-SAN HQ中盐核酸酶在细胞培养盐浓度下具有较高活性,缩短酶切时间、得到更短DNA片段;

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大多数研究级别的慢病毒是通过批次浓缩而不是粗制剂之后应用的,浓缩基本上是通过两步离心法产生的。在70000g通过超速离心浓缩后的慢病毒再通过蔗糖缓冲(50000g)纯化,然后溶解在配方缓冲液中。一种改进,特别是纯度方面的改进,基于离心/色谱联用的纯化方法。例如,Kutner等评估了组合纯化/浓缩方法。蔗糖缓冲的超速离心结合阴离子交换层析获得了88.2%的收率,而相反的组合则获得了77.6%的收率。在两种方法中,浓缩都超过了100倍,病毒滴度都超过了1010TU/ml(VSV-g包被的慢病毒)。

一般来说,生物生产工艺用的核酸酶以BenzonaseTM(BenzonaseTM是Merck的注册商标)为主,能高效降解任何形式(双链、单链、线状、环状)的DNA和RNA。该酶来自于大自然界普遍存在的S.Marcescen,通过E.coli发酵生产得到。该酶的适宜反应条件是低盐浓度范围(<100mM盐浓度),且酶活随着盐浓度上升而下降,在300mM盐浓度时酶活几乎丧失。对于细胞基因药物常用的两种病毒载体LV和AAV,LV由于含有脂包膜结构一般都在生理盐条件下存在,而AAV在高盐条件下不易团聚、更稳定。而在生理盐浓度及更高浓度条件下,Benzonase活性受到抑制。中盐核酸酶能够将单链及双链的DNA及RNA,消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。

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文章作者对酶法去除dsDNA进行了优化研究,两种酶浓度梯度为25U/ml、50U/ml及100U/ml,Mg2+浓度为5mM,通过PicoGreen检测dsDNA含量。结果发现,25U/ml的M-SAN HQ中盐核酸酶对dsDNA去除效果明显优于100U/ml的Benzonase。此外,在酶切反应速度方面,M-SAN HQ有更明显的优势,——在低浓度底物dsDNA(如20ng/ml)条件下,50U/ml的M-SAN HQ在5分钟内将dsDNA降解到2ng/ml左右;而50U/ml的Benzonase在30分钟孵育消化后,dsDNA浓度依然是12ng/ml左右。M-SAN HQ中盐核酸酶在生理盐浓度下具有较高活性,较适合盐浓度为125-250 mM。山西ArcticZymes中盐核酸酶70950-150

中盐核酸酶适宜pH范围广(pH7.2-8.7),且在125–250mM盐浓度内具有较高活性。湖北培养基条件中盐核酸酶70950-150

基因药物常用的AAV载体有三种生产方法,分别是三质粒瞬转体系、杆状病毒表达载体体系和包装细胞体系。其中,20多年前开发的三质粒瞬转表达技术仍然占据腺相关病毒AAV生产的主流地位,其三质粒分别是Helper质粒(含E2a/b、E4和VARNA基因)、目标基因表达质粒及辅助质粒(含Cap和Rep基因)。虽然AAV病毒载体的血清型不同,但AAV的生产流程基本一致,主要有质粒共转宿主细胞HEK293、293细胞生产病毒颗粒、从细胞培养上清或/及细胞裂解液中收获病毒载体、纯化/制剂/无菌过滤/灌装等流程。湖北培养基条件中盐核酸酶70950-150

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