双光子显微镜是激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术相结合的新技术。双光子激发的基本原理是:在光子密度较高的情况下，荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子，经过短暂的所谓激发态寿命后，发射一个波长较短的光子；效果和用波长为长波长一半的光子激发荧光分子是一样的。双(多)光子成像的优点是具有更深的组织穿透深度，红外光可以在平面上探测到极限为1mm的组织区域；因为信号背景比高，所以具有更高的对比度；由于激发体积小，具有定点激发、光毒性小的特点；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，更加安全。双光子显微镜比单光子共聚焦显微镜较大的不同在于无须使用孔限制光学散射。激光荧光双光子显微镜授权供应商
刚好双光子在这两点具有很大的优势在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup国外2PPLUS双光子显微镜成像视野一般是多少双光子显微镜大量运营在实验室当中；
双光子之源：飞秒激光双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。
双光子技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力，该领域还未形成标准和体系，还仍需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑，通过研究人体基于多光子成像技术，进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息，找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和特征的关联关系，共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制，筛选鉴定、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据，建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库，定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。讨论环节，来自病理科、呼吸中心、心脏科、神经科、皮肤科及研究所的多位医师及研究人员纷纷结合各自的工作领域与王爱民副教授展开了热烈的讨论，其中毛发中心杨顶权主任计划再次邀请王爱民副教授进行学术交流。通过本次学术交流，病理科与研究所分别与王爱民副教授课题组达成了初步的合作意向。双光子显微镜是结合了双光子技术和扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜。
双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室，双光子显微镜厂家就找滔博生物。美国ultima2PPLUS双光子显微镜光子跃迁
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在传统宽场显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整个样品的重叠像，没有纵向分辨能力。单光子激光共聚焦显微镜用***有效滤除了杂散光，分辨率有了本质上的提高，拥有了对样品的特定焦平面精细成像的能力，可以进行三维成像、动态成像等。然而，***在滤除杂散光的同时也将大部分来自焦平面的荧光滤除了，只有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，需要加大激发光功率，这又会导致对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白增加。双光子显微镜比较大的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应，与单光子共聚焦显微镜比较大的不同在于无须使用***限制光学散射，其具体优势如下。激光荧光双光子显微镜授权供应商
