三、流式细胞仪分析1、取对数生长期的细胞，接种到孔板，过夜培养。2、如果要进行药物刺激，在细胞中加入感兴趣的药物进行干预，继续培养一定时间后，收集细胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重悬细胞，37℃避光孵育15min或更长时间。【注意】：由于细胞种类和实验体系不同，Rhodamine123工作液浓度和孵育时间可以根据预实验或参考文献自行调整。4、用流式细胞仪检测。
四、实验案例1、取对数生长期A549细胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培养基）,37℃培养箱培养4-24h待其贴壁，以便后续实验操作.2、弃掉培养液，PBS洗涤两次.3、用培养基（无血清）稀释Rh123母液制备1～20µMRh123工作液。具体工作浓度取决于细胞类型和细胞浓度。4、将Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分钟.5、去除Rh123工作液并用PBS洗涤三次细胞去除背景色.6、荧光显微镜观察. Super Flour 系列荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH 4～10）, 更好的抗淬灭性。高分子荧光染料Fluor 647
CY5荧光染料是一种被广泛应用于生物分子检测和荧光成像等领域的高效、稳定的荧光标记试剂。它具有出色的荧光性能和良好的生物相容性。Cy5属于小分子染料，其*大发射波长为670nm，其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。Cy5.5含有一个游离胺基,可与多种官能团共轭,包括NHS酯和环氧化合物。激发和发射的最大值分别为678nm和694nm。Cy5.5已应用于各种基于荧光的实验中。Cy5.5是一种远红色(和近红外)发射染料,是荧光测量的理想选择。Cy5.5具有成本效益,且其标记化学操作简单,适合于潜在的***药物开发Cy5.5标记因子VIIa是用来想象**的。用这些靶向蛋白标记的Cy5.5在**异种移植物上特异定位至少14天,但未结合的Cy5.5不能定位于任何异种移植或***。这种**血管内皮细胞中抗组织因子的成像方法可用于检测原发性**和转移以及监测体内***反应[1]。pH/温度敏感磁性纳米凝胶结合Cy5.5标记乳铁蛋白(Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶)是一种有前途的胶质瘤术前MRI和术中荧光成像的对比剂[2]河南广州荧光染料D-荧光素钾盐小动物成像。
过标记——计算结果显示每摩尔145,000MW的蛋白标记的荧光团大于10mol。虽然过标记的蛋白也可以使用，但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。3．未结合染料难以去除——尽管大部分时候用分离柱可以较好的纯化蛋白偶联物，但仍可能会有痕量的游离染料留在偶联物溶液中，会使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。4．蛋白或蛋白偶联物无法洗脱——不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。
选择荧光染料时要考虑那些因素：激发波长处的消光系数应尽可能高：消光系数是衡量可以吸收多少光子的量度。量子产率应该尽可能高：这是吸收光子与发射光子的比率。消光系数和量子产率的乘积就是亮度。荧光染料应该是光稳定的：遗憾的是，比较不同公司染料的光稳定性的研究并不多。光致变色行为：对于STORM实验，您需要一个闪烁的荧光团。但是，对于分子跟踪实验，您***不想要闪烁的荧光团。活/死细胞渗透性。您想要的反应侧基（例如HaloTag、抗体等）。当您使用多个荧光探针时，尤其是当您量化共定位时，请谨慎处理其他颜色通道中的渗色。单独测试所有荧光探针以评估渗透。Super Fluor活化酯（与Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同）。
其他细胞结构常用染料生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用，除细胞膜研究外，我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索，例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等，而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色细胞染色神器DAPI+PhalloidinDAPI染色液（DAPIStainingSolution）常用于细胞核染色，可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽（Phalloidin）是细胞骨架的染色神器，罗丹明标记的Phalloidin（TRITC-Phalloidin）可将细胞染成橙红色，DAPI与Phalloidin染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂，染色效果可见A1-E1用TRITC-鬼笔环肽（橙红）染色的细胞骨架免疫荧光图；A2-E2用DAPI（蓝色）染色的细胞核免疫荧光图；A3-E3合并的L929细胞免疫荧光染色图。是S100A16过表达或下调前后PDAC细胞形态的变化。目前常用标记蛋白/抗体的荧光素主要有BODIPY类、香豆素类、罗丹明类、近红外类、NBD胺类以及菁染料等。化合物荧光染料ICG
荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用。高分子荧光染料Fluor 647
在1990年代***使用的绿色荧光蛋白（从水母维多利亚水母克隆）及其衍生物（例如藻红蓝蛋白、藻胆蛋白和藻红蛋白等）是当今生物学研究中**常用的一些生物荧光团。虽然荧光团可用于在细胞、细菌和各种***中表达质粒，但它们的使用有一些缺点，即它可能很耗时，并且在融合时还能够改变某些细胞蛋白的正常生物学功能。此外，与许多其他荧光团相比，生物荧光团的光稳定性和灵敏度较低。绿色荧光蛋白(GFP)绿色荧光蛋白是当下流行的生物荧光团之一，由238个氨基酸组成，其中三个负责发出可见绿色荧光的结构。在水母本身中，荧光团与水母发光蛋白（一种蛋白质）相互作用，当添加钙时会发出蓝光。通过DNA重组，研究人员可以使用负责产生蛋白质的基因来研究给定的基因和蛋白质。在这里，在将复合物插入细胞之前，该基因与另一个基因（负责产生所需蛋白质的第二个基因）结合。如果细胞产生绿色荧光，研究人员就可以明显看出该细胞能够表达目标基因。GFP由488nm激光线激发，可在510nm处检测。来自荧光团的微弱信号可以使用抗GFP抗体放大。作为生物标记物，绿色荧光蛋白用于以下功能：监测各种生理过程*识别蛋白质定位*检测转基因表达高分子荧光染料Fluor 647
