基因编码的荧光探针可用于在突触和细胞分辨率下监测体内神经元信号，这是揭示动物神经活动复杂机制的关键。双光子显微镜(2PM)可以对钙离子传感器和谷氨酸传感器进行亚细胞分辨率的成像，从而测量不透明脑深部的活动。成像膜的电压变化可以直接反映神经元的活动，但神经元活动的速度对于常规的2PM来说太快了。目前，电压成像主要由宽视场显微镜实现，但其空间分辨率较差，且只能在浅深度成像。因此，为了以高空间分辨率成像不透明脑中膜电压的变化，需要将成像速率提高2PM。面向模块输出端的子脉冲序列可视为从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成空间分离和时间延迟的聚焦阵列。然后，该模块被集成到一个带有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是重复频率为1MHz的920nm激光器。FACED模块可以产生80个脉冲焦点，脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像。虚光源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束可以沿Y轴比沿X轴更好地填充物镜，从而在X轴上产生0.82m和0.35m的横向分辨率。双光子显微镜有哪些应用呢？进口双光子显微镜厂家有哪些
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加地安全。国内荧光激光双光子显微镜磷光寿命计数双光子显微镜不需要共聚焦细孔，提高了荧光检测效率。
随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。深要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。
双光子显微镜的优势：在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。双光子显微镜使用的是高能量锁模脉冲器。
双光子之源：飞秒激光：双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜为什么穿透能力强?国内荧光激光双光子显微镜磷光寿命计数
双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。进口双光子显微镜厂家有哪些
许多生物医学成像方式，无论是单光子(共聚焦)或多光子(双光子)，都使用激光作为光源，并需要兼容的荧光染料。荧光染料有自己的激发波长，它们可以被单个光子以该激发波长的光子能量激发(E=hv=h*c/λ);或者是两个几乎同时到达的光子，但每个光子的能量约为单光子能量的一半，即双波长(0.5E->2λ)。前者是单光子显微镜原理，后者是双光子显微镜原理。在对同一种荧光染料进行成像时，双光子与单光子相比可以使用约两倍波长，因此双光子的散射较小(波长较长，散射较小)，可以更深入地渗透到组织中。进口双光子显微镜厂家有哪些
