肌内注射脂质体不能引起强烈的毒性反应,这与肺内或静脉注射途径的情况不同。几项体内研究表明,pDNA载体的肺内递送是促炎th1样细胞因子的产生和随后浸润细胞涌入肺区域的原因。在任何情况下,阳离子脂质本身不会引起免疫反应,而且这种效果不是由于pDNA制备中存在内***。在一项囊性纤维化临床试验中,急性轻度流感样症状被认为是由DNA依赖效应引起的,而对照组(*脂质组)没有观察到这种效应。有几种方法可以降低载体CpG基序的免疫刺激作用。这些包括这些基序中胞嘧啶碱基的甲基化,中和序列的添加,CpG基序的消除,使用化学或生物方法的免疫抑制,将载体靶向远离网状内皮系统的细胞,以及抑制内粒体酸化。研究表明,系统地消除pDNA载体中约50%的CpG基序,可导致体外小鼠脾细胞和静脉注射或鼻内滴注小鼠肺中细胞因子分泌减少。该方案还增加了转基因表达水平。利用肌内注射等途径,远离网状上皮系统进行被动靶向,也能提高转基因表达水平。常用的物理/机械转染方法包括电穿孔、声孔、基因显微注射和激光照射。甘肃小鼠转染试剂
在大肠杆菌细胞中复制的质粒通常含有二核苷酸频率为1:16的CpG基序,这与细菌DNA中的频率相似。CpG免疫刺激的两个应用领域是疫苗接种和肿瘤免疫***。许多出版物表明,免疫刺激CpG基序可以用于疫苗接种策略,包括给药编码抗原的pDNA载体或给药抗原本身。通过不同的给药途径给药含CpG的脂丛可以抑制**生长。这些结果来源于使用表达促炎细胞因子(如IL-12)的转基因或甚至不含外源转基因的载体的研究。**的生长抑制似乎是由CpG基序引起的,因为这些序列的甲基化否定了这种作用。虽然有***效果,但含CpG基序对**生长的抑制的确切性质尚不清楚。产生的细胞因子对肿瘤细胞和**脉管系统都有多重作用。一个恰当的例子是IL-12的能力,在响应含CpG基序时产生,引发抗血管生成反应。其他细胞因子,如IFN-g(自身为CpG诱导的细胞因子)诱导的细胞因子,即IP10和Mig,也能够具有抗血管生成特性。北京转染试剂阳离子脂质体合成中常用的分子是中性脂质二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在转染实验中使用对照对于确定所使用的转染试剂和核酸的效果和效率至关重要。通常,质粒转染和寡核苷酸转染实验都需要阳性对照、阴性对照、未转染对照和模拟转染对照。阳性对照是先前已被证明对转染实验产生已知影响的DNA或RNA,例如影响特定下游遗传靶点的表达。在转染工作的初始阶段,需要一个阳性对照来建立一个优化的转染方案,之后,阳性对照可以作为参考,与实验组进行比较。另一方面,阴性对照用于确认宿主细胞中预期的基因表达变化是否归因于转染而不是其他原因。在质粒DNA转染中,阴性对照可以是缺乏DNA和转染载体的反应,或者两者都没有,只有宿主细胞。在小RNA转染中,阴性对照包含一个非同源序列,该序列通常是一个与靶序列具有相同核苷酸长度和组成但与任何已知哺乳动物基因不同源的打乱序列。未转染的对照包括不含转染试剂和核酸的细胞培养,作为宿主细胞基本信息的对照,包括活力、表型,更重要的是,不受转染影响的靶基因的基线表达水平。模拟转染是指不含遗传靶标或核酸的转染,可以评估转染试剂(如背景自荧光噪声)产生的影响。在质粒转染实验中,推荐使用空质粒对照作为模拟转染对照。
在转染中,DNA通常通过病毒或非病毒载体(如质粒)转运到宿主细胞中。质粒的基本结构包括启动子、复制起点、多个克隆位点、目标基因和选择标记。质粒复制需要复制的起源,而多个克隆位点包含独特的内切酶切割位点,用于插入外源基因。适当的真核启动子(如CMV或EF-1a)的存在允许外源基因在宿主细胞中表达。质粒DNA可以以线性和超螺旋DNA的形式转染。与线性DNA相比,使用超螺旋质粒DNA转染通常会产生更高的效率,线性DNA更容易被外切酶降解。然而,线性化的DNA更具重组性,因此可以更容易地整合到宿主基因组中以实现稳定的转染。转染时推荐使用血清减少或无血清培养基包括阳离子转染试剂,如Lipofectamine、HiperFect 和EndofectinMax。
共转染是将一种以上类型的核酸引入真核细胞的过程。组合的一些例子包括多个质粒DNA ,siRNA和质粒DNA ,以及多个miRNAs进入同一个细胞。通常,多质粒DNA共转染的目的是将一种以上的外源基因导入宿主细胞。其应用之一是生产由几种质粒DNA成分组成的合成病毒或杂交载体。一个例子是在HEK293细胞系中,用转移、包膜和包装载体等几种质粒载体生成慢病毒。此外,多个质粒DNA的共转染也可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)研究,以研究一种蛋白质与另一种蛋白质之间的关系。基于病毒的转染,或者更具体地称为转导,涉及使用病毒载体将特定的核酸序列带入宿主细胞。浙江脂质体转染试剂
南京星叶生物正是利用将核酸封装在纳米级脂质体囊泡中的技术,开发出了Gemate系列转染试剂。甘肃小鼠转染试剂
基于非病毒的转染方法可以进一步分为物理/机械方法和化学方法。常用的物理/机械转染方法包括电穿孔、声孔、磁***、基因显微注射和激光照射。电穿孔是一种常用的物理转染方法,利用电压瞬间增加细胞膜通透性,允许外来核酸进入。这种方法通常用于转染原代细胞、干细胞和B细胞系等难以转染的细胞。然而,使用高压可能导致细胞坏死、凋亡和长久性细胞损伤。超声辅助转染或超声穿孔涉及使用微泡技术在细胞膜上制造孔,以减轻遗传物质的转移,而激光照射辅助转染使用激光束在质膜上制造小孔,允许外来遗传物质进入。与电穿孔一样,超声穿孔和激光辅助转染也有破坏细胞膜和不可逆细胞死亡的风险。相比之下,磁辅助转染,或使用磁力来帮助转移外来遗传物质的磁转染,似乎对生物的破坏性较尽管效率较低,但对宿主细胞的破坏较小。另一方面,基因显微注射涉及使用特定的针刺穿细胞,将所需的核酸注射到宿主细胞的细胞核中。然而,这项技术需要经过专门训练的人员或机器人系统,他们可以高精度地执行程序,以防止细胞损伤,因此在基因***等临床应用中具有重要价值。与物理或机械转染方法相比,化学转染涉及使用专门设计的化学品或化合物来帮助将外源核酸转移到宿主细胞中。甘肃小鼠转染试剂