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    并进行无内质粒抽提。GAG质粒和VSV质粒同样可以转化至感受态细菌DH5α中，并进行无内质粒抽提。质粒抽提后冷冻于-20℃保存。2、慢病毒包装1)使用DMEM完全培养基培养6cm皿HEK293T至汇合度为70~80%。采用opti-MEM和Lipo3000分别转染含有目的基因的pMSCV-eGFP、VSV、GAG质粒及对照载体，每皿加入脂质体-质粒转染混悬液按购买脂质体相关说明书操作定量。继续培养24h。2)24小时后，将培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基，放进细胞培养箱继续培养48~72h。3)48~72h后收集上层培养液，并过μm滤膜，采用ELISA法对所获得的慢病毒载体进行病毒滴度测定。如不及时使用可以冻存于-80℃。3、慢病毒转染1)转染前1天将细胞接种6孔培养板，时细胞的融合率约为50%，前需换液，加入1mLDMEM完全培养基。2)病毒冰浴融化后加入相应体积的病毒液及聚凝胺（Polybrene），混匀后放入37℃孵箱中继续培养3)4h后补充1mL培养基，14h后换液（24h内换液即可）。4)病毒72h后用倒置显微镜观察荧光，监测效率，出现较多荧光时将等量的转染细胞和未转染细胞分别加入等浓度Puromycin（Puromycin或其他筛选浓度需要事先摸索）。5)待未转染细胞全部死亡并且可观察到满意荧光量时，降低Puromycin浓度培养。神经科学研究平台，提供脑成像、电生理记录等服务，探索大脑结构与功能，助力神经退行性疾病研究。湖北整体科研技术服务

    细胞周期和凋亡技术服务（DH0003）一、服务介绍细胞周期（CellCycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。细胞凋亡（Cellapoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的**、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。二、服务内容及价格服务编号服务内容服务价格服务周期（工作日）DH0003-1细胞周期流式检测200元/样本7-10DH0003-2AnnexinV-FITC检测细胞凋亡300元/样本7-10DH0003-3TUNEL检测细胞凋亡300元/样本7-10DH0003-4蛋白免疫印迹C-cas3300元/样本7-10DH0003-5细胞凋亡流式检测300元/样本7-10三、客户提供1.客户需提供生长状态良好的细胞株及其他**（处理细胞**）实验材料，如药物、质粒、病毒等。湖南怎样科研技术服务机构体外诊断试剂研发，针对特定疾病标志物设计快速检测试剂，提高临床检测效率与准确性。

    无缝克隆的原理：在载体末端和引物末端应具有15-25个同源碱基（同源臂）。通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，三种酶同时发挥功能，从而达到单片段或多片段与载体连接的技术。T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填补缺口；DNA连接酶：两条DNA单链黏合起来。无缝克隆的特点传统分子克隆无缝克隆传统分子克隆和无缝克隆对比：单次插入片段：传统分子克隆一轮只能插入一个片段；无缝克隆单个至多个（≤5）。受限于酶切位点：传统分子克隆是；无缝克隆不是。引入多余序列：传统分子克隆是；无缝克隆不是。流程&操作时间：传统分子克隆流程繁琐，时间长。无缝克隆流程简单，时间短。克隆效率：传统分子克隆较低；无缝克隆单片段≥95%。实验流程1.载体制备载体的线性化：酶切（单酶切、双酶切）或反向PCR扩增。①酶切制备使用限制性内切酶进行载体线性化时，推荐使用双酶切方法进行，其次是单酶切。注意:1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或将目的产物进行纯化后再用于重组反应。②反向PCR扩增制备载体末端引物设计：反向PCR扩增制备线性化载体需要使用的引物。

    每孔中加入100μL无血清培养基，在培养箱中放置30min。4.接种细胞a.将状态良好的细胞进行消化，离心，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（需要做预实验确定具体的细胞密度）；b.在下室中加入500μL的含10%FBS的培养基，将小室小心放入24孔板内，在上室中加入细胞悬液100μL-200μL，放入培养箱中（需要做预实验确定具体的培养时间）。5.固定染色、拍照及计数a.到时间点后将小室取出，用PBS清洗小室，用棉签轻柔擦去上室细胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20min，将小室适当风干，用min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。b.将小室置于显微镜下，随机选取5个视野，拍照并计数。三、注意事项，分装时将整瓶Matrigel埋没在碎冰盒中，再将冰盒置于4℃冰箱中，建议放在冰箱靠后的位置，放置过夜，避免使用冰箱门进行解冻，因为其内装物的温度在反复打开时会迅速上升，导致材料过早凝胶化。分装后置于-20℃保存，长期保存可放于-80℃冰箱中；2.如何尽量避免增殖对结果的影响如果在侵袭实验期间发生了大量的增殖，那么计算出的侵袭数据将受到影响。因此，侵袭实验时间越短，增殖对数据的影响就越小。当然。蛋白质组学分析服务，利用质谱技术多面鉴定组织或细胞中的蛋白质种类与表达水平，助力疾病机制的深入研究。

    然后立即把细胞转移至提前准备的装有5-10ml预热的完全培养基的15ml离心管中；4、离心，小心移除上清；5、加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5%CO2,37℃）中培养；6、第二天观察细胞的贴壁情况，并进行换液。注意事项细胞复苏操作要求快速，否则细胞容易在冻融过程中产生冰晶，从而导致细胞死亡，所以必须提前准备好所需的培养基、培养耗材和其他所需物品，不允许临时准备；2.在解冻细胞前，必须把超净工作台准备至工作状态，提前准备装有5-10ml预热的完全培养基的15ml离心管；3.为了降低复温对其它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒中；4.存储架离开液氮罐的时间一般不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，冻存管子的液氮气化；5.放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染；6.细胞未冻融时（1min内）切勿取出观察；7.根据复苏细胞的大小选择合适的离心速度和时间，一般不超过1000RPM,10min；8.复苏后的第二天必须要进行换液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速度），以降低冻存保护剂DMSO的影响；9.离心速度和时间依据具体细胞决定；10.上述是以T25培养瓶为例。纳米药物递送系统，利用纳米技术提高药物靶向性，减少副作用，提升疗愈效果。湖南怎样科研技术服务机构

医学伦理与法律咨询服务，为医学科研项目提供伦理审查、知识产权保护等法律支持。湖北整体科研技术服务

    具体选用何种培养器皿取决于细胞生长密度需求（启动正常生长所需的密度）。二.细胞换液培养1、全量换液：把所有的旧培养液移除，加入新的培养液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速度）；2、半量换液：把旧培养液移至15ml离心管中，然后在培养器皿中加入适量新培养基（避免细胞离开培养液太久），把装有旧培养液的离心管进行离心（1000RPM,10min），离心后取适量旧培养上清至培养器皿中。注意事项1.全量换液适合于生长较快的肿瘤细胞，因为这些细胞可在短期内分泌足够的因子来支撑其生长；2.半量换液主要适合于生长较慢的原代细胞和干细胞，这些细胞很难在短期内分泌足够的因子来支撑其生长，旧培养液中恰好含有这些因子；3.新旧培养液的配比取决于细胞的密度和生长速度及其自身的特性，请参照具体细胞的培养建议，一般为3:1（新：旧）；4.如果细生污染，切勿进行半量换液。三.细胞传代培养1、当细胞密度达到其生长密度极限时（一般肿瘤细胞为80-100%，原代细胞和干细胞为80-90%，有些细胞为40-50%，熟知所养细胞的生长密度极限），移除旧培养液；2、用PBS洗涤两次（旧培养中的钙离子会抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培养瓶为例），立即盖好盖子。湖北整体科研技术服务