单光子显微技术是较成熟的荧光显微技术，但由于其使用的激发光波长较短，成像深度有限；能量较大,会造成对荧光物质的漂白,光毒性严重。激光共焦扫描显微镜由于共焦显微镜的孔径很小,实现样本三维成像要逐点扫描,成像速度慢,对样本损害大,很难用于长时间活细胞成像。而宽场显微镜能够很好地实现实时动态成像,光漂白小,因而较早应用于活细胞内的实时检测，但宽场显微镜由于离焦信号的干扰,难以实现多维成像。Derrick想重点介绍一下较为常用的观察设备——双光子荧光显微镜（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。双光子显微成像技术是近些年发展起来的结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新型非线性光学成像方法,采用长波激发，能对组织进行深层次成像。常用的比较好激发波长大多位于800-900nm，而水、血液和固有组织发色团对这个波段的光吸收率低，此外散射的激发光子不能激发样品，因此背景第，光损伤小，适用于在体检测。双光子荧光成像技术能准确定位细胞内置入的微电极位置，从而观察胞体、树突甚至单个树突棘的活性。研究者可完整的观察神经组织的分辨荧光图像,甚至可以分辨神经细胞单个树突棘中的钙分布。细胞内钙成像技术是通过向细胞内载入钙指示剂。哈尔滨动物神经元钙成像供应商
大家都知道，只有游离钙才具有生物学活性，而细胞质内钙离子浓度由钙离子的内外流平衡所决定，同时也受钙结合蛋白的影响。细胞外钙离子内流的方式有很多种，其中包括电压门控钙离子通道、离子型谷氨酰胺受体、烟碱型胆碱能受体（nAChR）和瞬时受体电位C型通道（TRPC）等。神经元钙成像的原理就是利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，以反映神经元活性。该方法可以同时观察多个功能或位置相关的脑细胞。合肥在体钙成像inscopix钙成像技术被广泛应用于同时监测成百上千个神经元内钙离子的变化。
细胞内钙离子作为重要的信号分子其作用具有时间性和空间性。当diyi个细胞兴奋时，产生了一个电冲动，此时，细胞外的钙离子流入该细胞内，促使该细胞分泌神经递质，神经递质与相邻的下一级神经细胞膜上的蛋白分子结合，促使这一级神经细胞产生新的电冲动。以此类推，神经信号便一级一级地传递下去，从而构成复杂的信号体系，*终形成学习、记忆等大脑的高级功能。在哺乳动物神经系统中，钙离子同样扮演着重要的信号分子的角色。静息状态下大部分神经元细胞内钙离子浓度约为50-100nM，而细胞兴奋时钙离子浓度能瞬间上升10-100倍，增加的钙离子对于突触囊泡胞吐释放神经递质的过程必不可少。
可见光激发Ca2+荧光探针：与紫外光激发探针相比，可见光激发Ca2+探针具有更强的染料吸收性能，对Ca2+变化水平检测敏感度也更高，能够降低对活细胞的光毒性和样品自发荧光以及光散射的干扰，且无光谱偏移。较常使用的可见光激发Ca2+荧光探针有Fluo-3，Fluo-4，Rhod-2等，同时他们也都是非比率型指示剂。Fluo-3是较常用的可见光激发Ca2+荧光指示剂之一，是典型的的单波长指示剂，比较大激发波长为506nm，比较大发射波长为526nm。它与Ca2+结合之前几乎无荧光，结合后荧光会增加60至100倍，从而避免了细胞自身的荧光干扰。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm（图3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦显微成像或流式细胞仪中。它还有一个升级版本Fluo-4，在相同Ca2+浓度下信号更强。传统钙成像实验要求成像的光路极为稳定。
转基因Ca2+指示剂：转基因技术和光遗传技术的飞速发展，催生了基因编码的Ca2+指示剂（GECIs）。它们不依赖于荧光染料，可以靶向特定的组织，如神经细胞、心肌细胞、T细胞等，并且可以避免荧光指示剂带来的的许多问题，是监测转基因动物体内钙离子的一个极好的工具。个基因编码的钙离子指示剂Cameleon早在1997年就发表了。它是利用与钙离子结合后发生结构变化，作为供体的CFP和作为受体的YFP之间产生FRET的原理。2000年，GCaMP诞生了。它是增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和钙调蛋白（结合钙离子）、钙调蛋白结合肽M13组成的，结合钙离子后，钙调素-M13相互作用引起GFP空间结构变化，发出绿色荧光（图5）。GCaMP的问世有着**性的意义，它改变了我们观察神经元群体活动的方式，让科学家们可以在成千上万的细胞中，看到哪些神经元在放电，它们放电的模式和规律是怎样的，从而进一步探索各种内在的神经机制。功能性多神经元钙成像是一种通过记录神经元内Ca2+信号变化,监测大量神经元动作电位的光学记录技术。在体钙成像inscopix
钙成像数据采集盒拥有 2TB 存储空间，可选择以太网或 Wifi 方式连接电脑。哈尔滨动物神经元钙成像供应商
近年来出现了通过植入性的microscope或microlens进行freelymoving动物钙成像的技术。如光纤成像法：使用一端带有GRINlens的光纤连接显微镜和动物大脑，从特定脑区发出的荧光信号被光纤收集，然后通过相机成像。动物头部只需植入GRINlens，方便活动，而且可以同时植入多个lens来观察不同的脑区之间的联系和相互作用。还有直接植入动物大脑的微型荧光显微镜，将GRINlens直接植入皮层下的海马，下丘脑，丘脑等区域，可以监测深部脑区的神经元活动。这种微型显微镜的重量只有几克，不会影响动物自由活动，可以提供800μm×600μm视野和1.50μm横向分辨率。哈尔滨动物神经元钙成像供应商
