单束扫描技术可以高速遍历大视场（FOV）的神经组织：使用MPM对神经元进行成像时，通过随机访问扫描—即激光束在整个视场上的任意选定点上进行快速扫描—可以只扫描感兴趣的神经元，这样不仅避免扫描到任何未标记的神经纤维，还可以优化激光束的扫描时间。随机访问扫描（图1）可以通过声光偏转器（AOD）来实现，其原理是将具有一个射频信号的压电传感器粘在合适的晶体上，所产生的声波引起周期性的折射率光栅，激光束通过光栅时发生衍射。通过射频电信号调控声波的强度和频率从而可以改变衍射光的强度和方向，这样使用1个AOD就可以实现一维横向的任意点扫描，利用1对AOD，结合其他轴向扫描技术可实现3D的随机访问扫描。但是该技术对样本的运动很敏感，易出现运动伪影。目前，快速光栅扫描即在FOV中进行逐行扫描，由于利用算法可以轻松解决运动伪影而被普遍的使用。从产品类型及技术方面来看，正置显微镜占据绝大多数市场。共聚焦多光子显微镜方案
继首代小型化双光子显微镜在国际上获得小鼠自由行为过程中大脑神经元和突触的动态图像后，我们成功研制了第二代小型化双光子显微镜。它具有更大的成像视野和三维成像能力，可以清晰稳定地对自由活动小鼠三维脑区的数千个神经元进行成像，实现对同一批神经元的一个月追踪记录。通过对微光学系统的重新设计系统的。微物镜工作距离延长至1mm，实现无创成像。内嵌可拆卸的快速轴向扫描模块，可采集深度180微米的3D体成像和多平面快速切换的实时成像。该扫描模块由一个快速的电动变焦透镜和一对中继透镜组成，在不同深度成像时可保持放大倍率恒定。其变焦模块重量，研究人员可根据实验需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探头可整体即时拔插，极大地简化了实验操作，避免了长周期实验时对动物的干扰。在重复装卸探头同一批神经元时，视场旋转角小于，边界偏差小于35微米。 共聚焦多光子显微镜方案多光子显微镜之类的先进光学技术能够在活生物体的大脑表面下更深地成像。
基于多光子显微镜的神经成像技术原理：多光子显微镜可用于深度成像和三维成像，因此可用于拍摄不透明的厚样品。目前主要使用的多光子显微镜包括双光子显微镜和三光子显微镜。双光子显微镜的结构与共焦类似，区别在于：1)双光子显微镜的激发光波长比共焦长，能量较低，但穿透能力较强；2)双光子显微镜没有小孔，提高了检测效率；3)双光子显微镜成像深度较快提高。那么，为什么双光子能具有共焦显微镜所没有的优势呢？原因是它采用双光子激发方式。使用波长较长的激发光子，光子的能量较低，因此电子需要吸收两个这样的激发光子才能达到激发态，从而释放出一个荧光光子。因此，荧光信号的强度与光强的平方成正比。因为焦点处的光强较大，只能在焦点处激发荧光。波长越长，穿透力越强，因此双光子显微镜的成像深度大于共焦显微镜。由于两个光子只在焦点激发荧光，不需要小孔，而是将所有的荧光都收集起来，提高了检测效率。三光子显微镜的原理类似于双光子显微镜，利用三个激发光子可以实现更深的成像深度。由于使用了更长的激发波长，穿透能力更强，成像深度更大。此外，由于较强的非线性效应，荧光信号的强度与光强的立方成正比，因此比双光子具有更低的非聚焦激发和背景噪声。
多光子显微优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收*局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；☆避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光：生物组织中的自发荧光物质的激发波长一般在350~560nm范围内，采用近红外或红外波段的激光作为光源，能**降低生物组织对激发光吸收。 双光子显微镜采用长波长激发。
与传统的单光子宽场荧光显微镜相比，多光子显微镜(MPM)具有光学切片和深度成像的功能，极大地促进了研究人员对整个大脑深部神经的认识。2019年，JeromeLecoq等从脑深部神经元成像、大数量神经元成像、高速神经元成像三个方面讨论了相关的MPM技术。为了将神经元活动与复杂行为联系起来，通常需要对大脑皮层深处的神经元进行成像，这就要求MPM具备深度成像的能力。激发光和发射光会被生物组织高度散射和吸收，这是限制MPM成像深度的主要因素。虽然增加激光强度可以解决散射问题，但会带来其他问题，如烧焦样品、散焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度的比较好方法是使用更长的波长作为激发光。另外，对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。 证实了多光子显微镜对皮肤和别的皮肤病的诊断的可行性。美国高速高分辨率多光子显微镜作用
多光子显微镜的分辨率比传统的单光子共聚焦要低的多。共聚焦多光子显微镜方案
某种物质能产生荧光，首要条件是分子必须具有吸收的结构，即生色团（分子中具有吸收特征频率的光能的基团）。其次，该物质必须具有一定的量子产率和适宣的环境。我们把分子中发射荧光的基团称为荧光团。荧光团一定是生色团，但生色团不一定是荧光团。因为，如果生色团的量子产率等于零，就不能发射出荧光，处于激发态的分子，可以由许多方式（如热，碰撞）把能量释放出来，发射荧光只是其中的一种方式。此外，一种物质吸收光的能力及量子产率又与物质所处的环境密切相关。共聚焦多光子显微镜方案
