指示剂是如何负载细胞，目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但明显提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）networkloading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）双光子显微镜大量运营在实验室当中。国内bruker双光子显微镜厂家
许多生物医学成像方式，无论是单光子(共聚焦)或多光子(双光子)，都使用激光作为光源，并需要兼容的荧光染料。荧光染料有自己的激发波长，它们可以被单个光子以该激发波长的光子能量激发(E=hv=h*c/λ);或者是两个几乎同时到达的光子，但每个光子的能量约为单光子能量的一半，即双波长(0.5E->2λ)。前者是单光子显微镜原理，后者是双光子显微镜原理。在对同一种荧光染料进行成像时，双光子与单光子相比可以使用约两倍波长，因此双光子的散射较小(波长较长，散射较小)，可以更深入地渗透到组织中。激光荧光双光子显微镜用途双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。
TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纤激光器是一种易于操作且无需维护的激光系统。其输出波长为920nm，非常适合常规荧光基团（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的双光子激发。能给荧光基团提供比较高的峰值功率，常用于神经科学和其他与激光有关的生物光子学学科。而且其独特设计（制造简单且经济高效的光源）对双光子荧光显微镜发展的革新具有潜在的可能。在双光子显微镜中，峰值功率就是亮度！如果您希望获得比较好的图像亮度，那么你就需要短脉冲，高功率，较重要的是需要干净的时间脉冲形状。FemtoFiberultra920具有足够高的输出功率，较短的脉冲和独特的Clean-Pulse技术，以及具有相对比较高的峰值功率，使得其在双光子显微镜中可以实现****的亮度，而不会对样品造成不必要的加热。FemtoFiberultra920交钥匙，完全集成的色散补偿（可确保样品处的脉冲较短），内置的功率控制，操作直观以及其坚固而紧凑的设计，使该系统具有极为友好的用户体验，是非线性显微镜应用的较好解决方案。例如荧光蛋白的双光子激发和基于SHG的对比机制。
系统示意图如图1所示，红外激光束从蓝宝石激光器出射后，由一个光学参量振荡器（OPO）转化到可见光波段，产生的可见光脉冲宽度为200 fs, 重复频率80 MHz，波长在490-750nm范围内可调谐。光束通过透镜及平面镜中继到包含微透镜阵列盘和阵列盘的共聚焦扫描单元中，形成用于荧光激发的多焦点光束。多焦点光束通过一个硅油浸润的物镜成像到样品上，激发荧光信号。荧光信号由同一个物镜收集并传输到阵列圆盘，产生共焦效应，隔离来自焦平面外的杂散光。双光子显微镜能够进行指标成像；
双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室，双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；激光荧光双光子显微镜用途
这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。国内bruker双光子显微镜厂家
光学显微镜从1590年发明以来，不断发展，促进生命科学日新月异的发现，帮助人类逐层打开生命本质的大门。同时，生命科学的发展不断给光学显微镜提出新的要求，促使成像理论和技术持续更新迭代。科学进入21世纪，人们已经不满足于在体外研究细胞和组织，需要能够更真实地探索生命，在体内实时观察细胞的发生和变化。此时，双光子显微镜进入了科学家的视野。在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，然后发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的（图1）。如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在单光子激发时，在波长为350 nm光的激发下发出450 nm荧光；而在双光子激发时，可采用700 nm的激发光得到450 nm荧光。国内bruker双光子显微镜厂家
