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原代细胞转染操作步骤（以24孔培养板为例）：A.细胞接种：转染前现在接种细胞，每孔500μl培养基（不可加物品），使细胞在转染时密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物准备：1.6pmolsiRNA用50μl无血清培养基稀释。2.2μlRFectPM用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25min内执行第三步操作，不要过于延迟。3.孵育5min后，将siRNA稀释液与RFectPM稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20min。C.将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：1.将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。2.37°C培养18-72h，检测基因克制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定较佳孵育时间。转染实验优化:为了提高转染效率，较好对转染条件进行优化，特别是开始使用。原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响。正规原代细胞分离试剂盒哪家便宜

原代细胞的培养和维持：1.消化培养法2.悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。3.部位培养部位培养是指从供体取得部位或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，部位培养可保持部位组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。南京原代细胞分离试剂盒直销厂家并且培养基中需包含细胞类型特定的营养因子、生长因子、葡萄糖和/或物品。

细胞培养注意事项及常见问题解答：1、培养基的选择依细胞种类而定。如果是从别的实验室借来的细胞，较初阶段一定要保持细胞原有的培养条件；特殊种类的细胞，比如内皮细胞，可以借鉴网上培养成功的条件，添加一些特定成分。2、液体培养基的保存条件应是冰箱4度冷藏。小六儿见过有的大实验室细胞量多，一次性购买的培养基瓶数也多，有些人可能觉得-20冰箱保存时间会更久一些。但是经过冷冻后的培养基再溶化时，你会发现培养基的颜色发生变化，颜色变深，这就是培养基的PH值升高了。3、培养基中都含有大量的谷氨酰胺，用来合成细胞生长所需要的核酸和蛋白质。但是谷氨酰胺在溶液中不稳定，保存4周后的培养基需要重新加入谷氨酰胺。所以尽量不要大批量购买培养，也不要一次配太多的培养基。

取材的基本要求和注意事项叙述如下：一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在除去表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓。用专门的原代细胞培养基进行培养，较大限度提高原代细胞的生长。

关于细胞株和细胞系以及原代细胞的区别：1、获取方法不同，原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞；细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物；细胞系是原代细胞培养物经开始传代成功后所繁殖的细胞群体。2、原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40--50代，这种传代细胞叫做细胞株；细胞株的遗传物质没有发生改变。当细胞传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。用70％的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。无锡原代细胞分离试剂盒供应商

原代内皮细胞和血管平滑肌细胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纤维细胞生长因子。正规原代细胞分离试剂盒哪家便宜

原代细胞的获取：1.培养时间无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间较少需要一周以上的时间，期间可换液或者传代。2.换液时间无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。3.细胞状态判断正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。下图均为比较健康的原代细胞图（左：小鼠成纤维细胞；右：鸡胚成纤维细胞；下：人成纤维细胞）。正规原代细胞分离试剂盒哪家便宜